מסנן פלואורסצנטי הוא מרכיב חיוני במיקרוסקופ פלואורסצנטי. למערכת טיפוסית יש שלושה מסננים בסיסיים: מסנן עירור, מסנן פליטה ומראה דיכרואית. בדרך כלל הם ארוזים בקובייה כך שהקבוצה מוכנסת יחד למיקרוסקופ.
כיצד פועל מסנן פלואורסצנטי?
מסנן עירור
מסנני עירור מעבירים אור באורך גל מסוים וחוסמים אורכי גל אחרים. ניתן להשתמש בהם כדי לייצר צבעים שונים על ידי כוונון המסנן כך שיאפשר רק צבע אחד לעבור. מסנני העירור מגיעים בשני סוגים עיקריים - מסנני מעבר ארוך ומסנני פס פס. המעורר הוא בדרך כלל מסנן פס העובר רק את אורכי הגל הנספגים בפלואורפור, ובכך ממזער עירור של מקורות קרינה אחרים וחוסם אור עירור ברצועת פליטת הקרינה. כפי שמוצג על ידי הקו הכחול באיור, BP הוא 460-495, מה שאומר שהוא יכול לעבור רק דרך הקרינה של 460-495 ננומטר.
הוא ממוקם בתוך נתיב ההארה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסנן את כל אורכי הגל של מקור האור למעט טווח עירור הפלואורופור. השידור המינימלי של המסנן מכתיב את הבהירות והברק של התמונות. מומלץ לפחות 40% שידור עבור כל מסנן עירור, כך שההילוך יהיה באופן אידיאלי מעל 85%. רוחב הפס של מסנן העירור צריך להיות לגמרי בטווח עירור הפלואורופור כך שאורך הגל המרכזי (CWL) של המסנן יהיה קרוב ככל האפשר לשיא אורך גל העירור של הפלואורופור. צפיפות אופטית של מסנן עירור (OD) מכתיב את כהות תמונת הרקע; OD הוא מדד של עד כמה מסנן חוסם את אורכי הגל מחוץ לטווח השידור או רוחב הפס. OD מינימום של 3.0 מומלץ אבל OD של 6.0 ומעלה הוא אידיאלי.
מסנן פליטה
מסנני פליטה משרתים את המטרה לאפשר לקרינה הרצויה מהדגימה להגיע לגלאי. הם חוסמים אורכי גל קצרים יותר ויש להם שידור גבוה עבור אורכי גל ארוכים יותר. סוג המסנן משויך גם למספר, למשל BA510IF באיור (מסנן מחסום הפרעות), שהייעוד מתייחס לאורך הגל ב-50% מהשידור המרבי שלו.
אותן המלצות עבור מסנני עירור מתקיימים עבור מסנני פליטה: שידור מינימלי, רוחב פס, OD ו-CWL. מסנן פליטה עם השילוב האידיאלי של CWL, מינימום שידור ו-OD מספק את התמונות הבהירות ביותר האפשריות, עם החסימה העמוקה ביותר האפשרית, ומבטיח זיהוי של אותות הפליטה הקלושים ביותר.
מראה דיכרואית
המראה הדיכרואית ממוקמת בין מסנן העירור למסנן הפליטה בזווית של 45° ומשקפת את אות העירור לכיוון הפלואורופור תוך העברת אות הפליטה לכיוון הגלאי. למסננים דיכרואיים ולמפצלי אלומה אידיאליים יש מעברים חדים בין השתקפות מקסימלית לשידור מקסימלי, עם השתקפות של>95% לרוחב הפס של מסנן העירור ותמסורת של>90% לרוחב הפס של מסנן הפליטה. בחר את המסנן תוך התחשבות באורך הגל של הצומת (λ) של הפלואורופור, כדי למזער אור תועה ולמקסם את יחס האות לרעש של תמונת פלורסנט.
המראה הדיכרואית באיור זה היא ה-DM505, הנקראת כך מכיוון ש-505 ננומטר הוא אורך הגל ב-50% מהשידור המקסימלי של מראה זו. עקומת השידור של מראה זו מציגה שידור גבוה מעל 505 ננומטר, ירידה תלולה בשידור משמאל ל-505 ננומטר, והחזרה מרבית משמאל ל-505 ננומטר, אך עדיין עשויה להיות שידור מסויים מתחת ל-505 ננומטר.
מה ההבדל בין מסנני מעבר ארוך לפס פס?
ניתן לחלק מסנני פלואורסצנטי לשני סוגים: מעבר ארוך (LP) ומעבר פס (BP).
מסנני מעבר ארוך משדרים אורכי גל ארוכים וחוסמים את הקצרים יותר. אורך הגל המופסק הוא הערך ב-50% משיא השידור, וכל אורכי הגל שמעל לחתוך מועברים על ידי מסנני המעבר הארוך. הם משמשים לעתים קרובות במראות דיכרואיות ובמסנני פליטה. יש להשתמש במסנני Longpass כאשר היישום דורש איסוף פליטה מקסימלי וכאשר הבחנה ספקטרלית אינה רצויה או הכרחית, מה שקורה בדרך כלל עבור בדיקות המייצרות מין פולט יחיד בדגימות עם רמות נמוכות יחסית של אוטופלואורסצנטי רקע.
מסנני פס מעבר משדרים רק פס אורך גל מסוים וחוסמים אחרים. הם מפחיתים דיבור על ידי מתן אפשרות לשידור רק לחלק החזק ביותר של ספקטרום פליטת הפלואורופורים, מפחיתים רעש אוטומטי פלואורסצנטי ובכך משפרים את יחס האות לרעש בדגימות אוטופלואורסצנטיות ברקע גבוהות, אשר מסנני מעבר ארוך אינם יכולים להציע.
כמה סוגים של ערכות מסנני פלואורסצנטיות BestScope יכולה לספק?
כמה סוגים נפוצים של מסננים כוללים מסננים כחולים, ירוקים ואולטרה סגולים. כפי שמוצג בטבלה.
| סט מסננים | מסנן עירור | מראה דיכרואית | מסנן מחסום | מנורת LED אורך גל | בַּקָשָׁה |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 ננומטר | ·FITC: שיטת נוגדנים פלורסנטיים ·תפוז חומצה: DNA, RNA ·אוראמין: חיידק שחפת ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 ננומטר | ·Rhodamine, TRITC: שיטת נוגדנים פלורסנטיים ·פרופידיום יודיד: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 ננומטר | · תצפית פלואורסצנטית אוטומטית ·DAPI: צביעת DNA ·Hoechest 332528, 33342: משמש לצביעה של כרומוזומים |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 ננומטר | ·קטכולאמינים ·5-הידרוקסי טריפטמין · טטרציקלין: שלד, שיניים |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 ננומטר | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
ערכות מסננים המשמשות ברכישות פלואורסצנטיות מתוכננות סביב אורכי הגל העיקריים המשמשים ביישומי פלואורסצנטי, המבוססים על הפלואורופורים הנפוצים ביותר. מסיבה זו, הם נקראים גם על שם הפלואורופור שהם מיועדים להדמיה, כגון קוביות סינון DAPI (כחול), FITC (ירוק) או TRITC (אדום).
| סט מסננים | מסנן עירור | מראה דיכרואית | מסנן מחסום | מנורת LED אורך גל |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 ננומטר |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 ננומטר |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 ננומטר |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450 ננומטר |
| טקסס אדום | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 ננומטר |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 ננומטר |
איך בוחרים מסנן פלואורסצנטי?
1. העיקרון של בחירת מסנן הקרינה הוא לתת לאור הקרינה/פליטה לעבור דרך קצה ההדמיה ככל האפשר, ולחסום לחלוטין את אור העירור בו זמנית, כדי להשיג את יחס האות לרעש הגבוה ביותר. במיוחד עבור היישום של עירור מולטיפוטונים ומיקרוסקופ השתקפות פנימית מוחלטת, הרעש החלש יגרום גם להפרעה גדולה לאפקט ההדמיה, כך שהדרישה ליחס אות לרעש גבוהה יותר.
2. דע את ספקטרום העירור והפליטה של הפלואורופור. כדי לבנות מערך מסנני פלואורסצנטי שיוצר תמונה באיכות גבוהה עם ניגודיות גבוהה עם רקע שחור, מסנני עירור ופליטות צריכים להשיג שידור גבוה עם אדוות פס מעבר מינימליות על האזורים התואמים לשיאי עירור פלואורופורים או פליטות.
3. שקול את העמידות של מסנני הקרינה. מסננים אלו חייבים להיות אטומים למקורות אור עזים היוצרים אור אולטרה סגול (UV) שעלול להוביל ל"שחיקה", במיוחד של מסנן המעורר כיוון שהוא נתון למלוא עוצמת מקור ההארה.
תמונות הדגימה הפלורסנטיות השונות
המשאבים נאספים ומאורגנים באינטרנט, ומשמשים רק ללמידה ותקשורת. אם יש הפרה כלשהי, אנא צור איתנו קשר כדי למחוק.
זמן פרסום: דצמבר-09-2022